冷冻保存即通过降低温度冷冻的方法来保存结构完整的活细胞和组织，冷冻保存技术造成的损伤主要是由于形成冰晶导致的机械损伤以及冷冻保护剂带来的毒性损伤。

当前临床上应用的卵子冷冻保存方法主要有两种：慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。

慢速冷冻是通过加入低浓度的抗冻保护剂，加入抗冻保护剂后细胞内的水分在一定温度范围内不冻结，缓慢降温，细胞外液先逐渐形成冰晶，浓度变高，利用渗透压使卵母细胞中的水分在冻结前脱出，从而进行冷冻保存，然而慢速冷冻过程中，冷冻和复苏的速率、抗冻保护剂对细胞的影响以及冷冻过程中不可避免会形成冰晶，都可能会对卵子有一定影响。因此，胚胎/卵母细胞玻璃化冷冻已成为最为成熟的保存方法，广泛应用于辅助生殖临床工作中。

玻璃化冷冻是一种快速的冷冻方式，其抗冻保护剂是高浓度的保护剂，即浓度在6mol/L以上的抗冻保护剂，卵子放置在高浓度抗冻保护剂的过程中发生了脱水，同时玻璃化冷冻还利用了高浓度的抗冻保护剂在过冷状态下会形成浓稠液体这一特性，这样直接投入液氮急速冷冻时，液体黏度增加，当凝度达到临界值时发生凝固化，直接形成了透明的固态，避免了慢速冷冻过程中冰晶的形成。卵母细胞玻璃化冷冻的操作步骤如图1所示。

因此，玻璃化冷冻很好地解决了传统慢速冷冻方案解冻后存活率低的问题。玻璃化冷冻后的卵母细胞，其存活率、受精率、卵裂率以及所形成胚胎的质量，甚至可与新鲜卵母细胞的结局相当。

卵子冷冻保存已广泛地应用在患有癌症需要进行化疗、放疗等损害生育力的年轻女性上。我国女性生育力保存专家共识提出，对于乳腺癌、淋巴瘤、妇科肿瘤等好发于年轻女性的肿瘤和有生育力下降高风险的非肿瘤疾病如子宫内膜异位症、风湿免疫疾病的患者，应当尽早确定治疗过程对生育力的影响程度，对有生育意愿的、疾病预后良好的患者尽早地开展生育力保存。美国临床肿瘤学会(ASCO)发布的癌症女性生育力保存指南也极力建议临床医生在开展有损害生殖系统的治疗时要提前告知患者，并对患者进行生育力保留的评估，制定相应的方案，尽可能地保留有生育意愿女性的生育力。

（图片来源www.pexels.com）

45岁以下新诊断的子宫颈癌(36. 5%)、卵巢癌(12%)、子宫内膜癌(6. 5%)的比例越来越高，而癌症的主要治疗方式：手术切除、化疗、放疗均对女性生育力会造成一定的损害；手术至妊娠时间<6个月可增加30%~60%早产风险，化疗常用的紫杉醇类、铂类等药物的毒性会导致经闭、致畸、早产风险，化疗≤1年内怀孕的女性，其早产的风险是化疗1年妊娠女性的1.9倍。放疗可诱导原始卵泡的卵母细胞凋亡甚至直接导致闭经，且育龄期年龄越大的女性，在放疗后发生卵巢功能衰竭的概率越高。

随着首次生育年龄的推迟以及相当多的女性在育龄期确诊癌症，越来越多的女性有了保存生育力的需求。 随着癌症生存率的提高，生殖健康在患者远期的生活质量中也变得更加重要。卵子冷冻较胚胎冷冻更容易有损伤，但仍有多方报道了卵母细胞冷冻后试管婴儿成功的案例，当前冷冻保存技术的进步使得卵子冷冻保存在女性生育力保存方面的可行性提高。

一项回顾性匹配队列研究表明，玻璃化冷冻的卵母细胞较新鲜卵母细胞的受精率、胚胎形态学评分降低。Cobo等的一项研究显示，玻璃化冷冻的卵母细胞存活率高于慢速冷冻卵母细胞（OR=2.46），受精率也更高（OR=1.50），玻璃化冷冻的优质胚胎率（22.4%）远高于慢速冷冻的优质胚胎率（8.0%)。这一定程度上说明了冷冻保存对卵子的损伤问题仍然存在，玻璃化冷冻在卵子冷冻保存方面也许是更优的选择。

目前成熟卵母细胞玻璃化冷冻存活率可达80%~95%，胚胎移植周期平均临床妊娠率为30%累计活产率为 33%。因此建议有生育力保存需求的女性尽早进行卵母细胞冷冻和妊娠。

（图片来源www.pexels.com）

●卵母细胞超微结构的破坏

由于卵子有较低的表面体积比、灵敏的能量代谢以及减数分裂的纺锤体，使得其对冷冻保存引起的物理和化学损伤特别敏感，使用电子显微镜观察冷冻保存对卵子的影响时，最具代表性的细胞器是与线粒体相关的光滑内质网的聚集体以及卵质囊泡被线粒体包围后形成的线粒体囊泡复合物，胞质中形成的液泡也可能是由于卵子接触冷冻保护剂后卵母细胞皮层形成隐窝样内陷和内吞囊泡簇导致的，因此液泡也可以作为冷冻损伤的特定指标。

●卵子空泡化

一项Meta分析表明，空泡会显著降低卵母细胞受精的概率。空泡化因通常和细胞死亡相关联而被认为可能是导致细胞死亡的机制之一，但根据Shubin等的研究，空泡化更像是细胞应对危机的一种手段和呈现方式，冷冻保存后卵母细胞超微结构的破坏导致大量活性氧类(reactive oxygen species, ROS)的生成，卵母细胞发生氧化应激导致了空泡化的形成。

●线粒体氧化应激

冷冻保存过程中会导致卵母细胞的线粒体损伤，从而影响其功能并增加ROS产生。ROS的生成超过细胞抗氧能力即产生氧化应激反应，会影响卵母细胞正常发育成熟，导致炎性微环境的形成，对卵母细胞造成损伤，破坏卵母细胞的功能。动物实验研究已经证实抗氧化剂如褪黑素、白藜芦醇、左旋肉碱、辅酶 Q10等可以有效提高卵母细胞的存活，改善受精率，提升胚胎质量。

●基因表达及表观遗传的改变

卵母细胞玻璃化冷冻后会出现表观遗传的改变，这些改变导致其较之新鲜胚胎更容易产生不良的胚胎发育结局。

（图片来源www.pexels.com）

文献来源|周璇, 郭莎娜, 陈其臻,等.卵子冷冻在女性生育力保存中价值的研究进展[J].《同济大学学报（医学版）》,2024,1:152-157.